Évaluation du succès de la thérapie génique CRISPR à l’aide de la ddPCR

L’utilisation d’outils analytiques plus précis peut fournir une évaluation plus claire des résultats de l’édition génétique.

Bien que beaucoup n’en aient jamais entendu parler, la -thalassémie est l’une des maladies autosomiques récessives les plus courantes dans le monde et constitue un trouble sanguin grave. Les scientifiques estiment qu’environ 1,5 % de la population mondiale est porteuse de mutations associées à la -thalassémie, avec plus de 60 000 nouveaux cas diagnostiqués chaque année (1). Ce trouble sanguin réduit la production d’hémoglobine, une protéine contenant du fer dans les globules rouges qui joue un rôle important dans l’apport d’oxygène dans tout le corps. Par conséquent, les scientifiques et les chercheurs tentent de proposer des thérapies géniques pour traiter la -thalassémie et corriger les déséquilibres génétiques sous-jacents qui causent la maladie.

Une approche prometteuse consiste à utiliser des répétitions palindromiques courtes régulièrement groupées (CRISPR) pour réparer les gènes mutés. Cependant, les scientifiques travaillent toujours pour améliorer et valider l’efficacité d’édition de CRISPR. De plus, la capacité de CRISPR à corriger avec succès les mutations associées à la -thalassémie reste incertaine. Par conséquent, les chercheurs doivent associer le protocole d’édition CRISPR à des outils de contrôle de la qualité, tels que la réaction en chaîne par polymérase numérique des gouttelettes (ddPCR), qui détecte avec précision la présence d’une édition CRISPR réussie.

Solutions complexes d’édition de gènes

Lors de la correction des mutations avec -thalassémie, les scientifiques n’ont pas de voie directe pour traiter cette condition au niveau génétique. L’hémoglobine adulte se compose de deux sous-unités de globine, -globine et -globine, qui doivent être exprimées en quantités égales pour que l’hémoglobine se développe correctement. Les personnes atteintes de -thalassémie ont une mutation génétique dans le gène de la -globine, HBB, entraînant une régulation négative des gènes. Avec des quantités déséquilibrées de -globine et de -globine dans la circulation, la -globine libre forme des dépôts toxiques qui interfèrent avec le développement des globules rouges et tuent les globules rouges matures. En conséquence, les patients peuvent ressentir divers symptômes graves, notamment un risque accru de caillots sanguins, de faiblesse et de fatigue, qui entraînent souvent une mort prématurée.

Plusieurs études ont montré que la suppression du gène -globine, HBA, peut améliorer le rendement. Ou, introduisez des aliments sains HBB via un vecteur lentiviral améliore les résultats cliniques d’un patient, mais seulement si ce patient exprime déjà de la -globine (2). Un groupe de recherche basé en France et en Italie a récemment combiné ces deux approches : ils ont utilisé CRISPR pour supprimer une seule copie du HBA2 et le remplacer par HBB dans l’espoir de rétablir l’équilibre entre les deux sous-unités d’hémoglobine (3).

Faire ce genre de double édition est une tâche délicate. Les chercheurs doivent d’abord concevoir un guide d’ARN (ARNg) pour trouver le gène à éditer. Une fois que l’ARNg a identifié le bon site contenant HBA gène, Cas9 devrait effectuer la coupe et faciliter l’insertion HBB gène au bon endroit HBA gènes précédemment occupés. L’approche de double édition ne fonctionne que si CRISPR supprime correctement HBA et présenter HBB au même endroit. L’évaluation du succès de cette technique nécessite un contrôle de qualité strict pour s’assurer que CRISPR effectue les modifications correctes. C’est là que la technologie ddPCR entre en jeu.

Avantages du test ddPCR

Alors que les chercheurs utilisent généralement la réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) pour évaluer le succès de l’édition de gènes, cette technique peut présenter des inconvénients, notamment en ce qui concerne la quantification. La qPCR ne peut estimer le nombre de copies du transgène qu’en s’appuyant sur la courbe standard de dilution en série pour interpréter l’échantillon. Par conséquent, les résultats sont moins sensibles et ne peuvent pas être mesurés à un gène par cellule. En revanche, la ddPCR est bien adaptée à la tâche, car elle fournit une quantification absolue des acides nucléiques sans l’aide de courbes standard. La technologie ddPCR est un outil très sensible conçu pour détecter et mesurer des variants génétiques rares, et peut être utilisé pour détecter les résultats d’édition CRISPR. Par exemple, les chercheurs ont utilisé le test ddPCR pour détecter l’édition CRISPR par le biais d’une réparation dirigée par homologie et d’un couplage d’extrémité non homologue (4).

La technologie ddPCR fonctionne en divisant l’échantillon en gouttelettes d’environ 20 000 nL et en exécutant une réaction PCR distincte dans chacune. Chaque gouttelette contient un ou plusieurs brins d’acide nucléique. Si une gouttelette contient un brin avec la séquence génétique cible, l’ADN s’amplifiera et la gouttelette émettra un signal fluorescent puissant. En revanche, si la goutte ne contient pas la séquence cible, la goutte n’émettra qu’un faible signal de fluorescence. En comptant les gouttelettes fluorescentes fortes et faibles, les scientifiques peuvent détecter des séquences spécifiques avec une sensibilité précise et mesurer la concentration de la séquence cible dans l’échantillon d’origine.

Comparée au séquençage de nouvelle génération, la technologie ddPCR est rapide, peu coûteuse et demande moins de main-d’œuvre, et peut détecter des événements rares sans être limitée par la profondeur de lecture (5). La technologie ddPCR est également plus sensible et précise que la qPCR. Un groupe de recherche franco-italien a utilisé le test ddPCR pour évaluer le succès de leur approche à double édition pour traiter la -thalassémie (3). Les chercheurs ont utilisé la technologie ddPCR pour la première fois pour mesurer HBA nombre de copies, qui est en corrélation avec la sévérité de la -thalassémie. Ils utilisent également la technologie pour détecter le succès de l’insertion HBB. Dans les cellules progénitrices érythroïdes dérivées du sang de cordon humain, l’équipe a démontré une forte insertion de HBB gène, confirmant l’intégration du gène au niveau de la cible à 0,8 copies par cellule.

L’équipe n’a pas été en mesure de détecter cette intégration à l’aide de la qPCR. En raison de la variabilité inhérente à la mesure des résultats de la qPCR, cette technique ne peut pas détecter les copies de gènes à des concentrations inférieures à deux ou trois copies par cellule. Sans la technologie ddPCR, ces chercheurs n’auraient pas démontré que leur stratégie CRISPR a le potentiel pour de futurs tests cliniques.

La future application CRISPR

Près de 40 essais cliniques étudient actuellement si CRISPR peut être utilisé pour traiter les maladies génétiques, et les organismes de réglementation pourraient approuver la première thérapie génique basée sur CRISPR en moins d’une décennie (6). Mais étant donné les défis permanents liés au développement de protocoles d’édition CRISPR fiables, les sociétés biopharmaceutiques développant des thérapies CRISPR doivent veiller à ce que leurs thérapies soient sûres et efficaces en utilisant des outils tels que la technologie ddPCR pour fournir la confiance dont elles ont besoin. Par exemple, le test ddPCR peut être conçu pour détecter toutes les modifications CRISPR en utilisant une sonde couvrant la jonction entre le génome d’origine et la séquence du donneur. Les chercheurs et les fabricants biopharmaceutiques peuvent dépister les lignées cellulaires contenant des modifications ayant échoué avant même qu’elles n’atteignent les patients en analysant les lignées cellulaires pour des modifications CRISPR spécifiques. Ceci, à son tour, augmentera les chances de succès clinique de la thérapie génique basée sur CRISPR et ouvrira la porte à des traitements de nouvelle génération pour les maladies génétiques difficiles à traiter, telles que la -thalassémie.

Référence

1. R. Galanello et R. Origa, Orphanet J Rare Dis. 5 (11) (2010).
2. S. Mettananda, et al., Sang. 125 (24) 3694–3701 (2015).
3. G. Pavani, et al., Sang Adv. 5 (5) 1137–1153 (2021).
4. Y. Miyaoka, et al., Méthode Mole Biol. 1768, 349–362 (2018).
5. C. Peng, et al., Devant. Sciences végétales. 11 (2020).
6. Bibliothèque nationale de médecine des États-Unis, « NIH », www.clinicaltrials.govconsulté le 8 mars 2022.

A propos de l’auteur

Marwan Alsarraj est responsable du segment biopharmaceutique, groupe de biologie numérique, chez Bio-Rad.

Détails de l’article

Technologie pharmaceutique
vol. 46, Non. 5
Mai 2022
Pages : 20–21

Devis

Si vous vous référez à cet article, veuillez le citer comme M. Alsarraj, « Assessing the Success of CRISPR Gene Therapy Using ddPCR, » Technologie pharmaceutique 46 (5) 20–21 (2022).

Lancelot Bonnay

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